[摘要] 目的：研究华蟾素乳剂对实体肿瘤的疗效及其可能的作用机制。方法：本研究运用Lewis肺癌小鼠模型，观察华蟾素乳剂对小鼠Lewis肺癌的疗效、免疫功能的影响。结果：华蟾素乳剂治疗小鼠Lewis肺癌能抑制肿瘤的生长，抑瘤率高达32.7%，稳定病灶，提高荷瘤小鼠的生存质量，明显提高校正廓清指数α（P＜0.01）以及溶血素水平（P＜0.05），改善免疫功能。结论：华蟾素乳剂对小鼠Lewis肺癌有明显疗效，其作用机制与其本身对Lewis肺癌实体瘤有抑制作用和提高荷瘤小鼠免疫功能有关。

　　[关键词] 华蟾素乳剂；Lewis肺癌；廓清指数α；溶血素[中图分类号] R965；R734.2[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）04（a）-022-03Experimental study of effects of Huachansu Parenteral Emulsion on Lewis lung carcinoma in miceLIANG Xin, ZHANG JieCollege of Pharmacy, Qiqihar Medical University, Heilongjiang Province Qiqihar 161006, China[Abstract] Objective: To study the therapeutic effects of Huachansu Parenteral Emulsion （HCSPE） in mice and possible mechanism. Methods: The mice with Lewis lung carcinoma was used as a model for observing the therapeutic effect, the immunomodulatory functions, and changes of quality of life. Results: HCSPE inhibited the growth of tumor as the tumor inhibition ratio of 32.7%, enhanced clearance index α （P＜0.01） and serum hemolysin level （P＜0.05） obviously, increased life quality and the immunity of mice with Lewis lung carcinoma. Conclusion: HCSPE has therapeutic effects in mice with Lewis lung carcinoma. It′s mechanism might be associated with improving the immunity of mice with Lewis lung carcinoma.

　　[Key words] Huachansu Parenteral Emulsion; Lewis lung carcinoma; Clearance index α； Hemolysin华蟾素是中华大蟾蜍皮的水制剂，临床发现它对消化系肿瘤有较好的疗效，有报道称华蟾素对人肝癌、胃癌、结肠癌细胞具有体外杀伤作用，但未明确其对肺癌的治疗效果[1-3]。目前，市售的华蟾素制剂以水溶性注射剂（HCSPE）为主，同时还有水溶性口服液、片剂及胶囊，但未见华蟾素乳剂的相关报道[4-6]。由于乳剂对药物具有缓释、靶向定位、稳定等作用以及降低毒性等独特优点，故近年来中药静脉注射乳剂在抗肿瘤、抗心血管、抗病毒等载体方面中的应用发挥了独特作用。将华蟾素制成乳剂[7]，利用蟾毒灵等蟾毒内脂类成分具有亲脂性的性质，可提高药物的稳定性和抗肿瘤有效成分的含量，降低药物用量；而且由于乳剂的缓释及靶向作用，也可增强药物的疗效，降低毒副作用。本实验运用Lewis肺癌小鼠模型，观察华蟾素乳剂对Lewis肺癌的治疗作用，根据碳粒廓清实验和小鼠溶血素实验结果探讨华蟾素乳剂的抗肿瘤作用机制，结果表明其抗瘤作用与其提高小鼠免疫功能有关。

　　1 材料与方法1.1 药品印度墨汁（3D 065 Indian Ink 50ml Z.Negativdarsrellung von Bakterien Producted May 2006/5CH.B：4220Waldeck GmbH ＆ Co.KG Division ChromaHavixbecker Straβe 62.D—48161 Munster）；环磷酰胺（山西普德药业有限公司，批号：20070307）；Na2CO3（天津市博迪化工有限公司，批号：20060721）；枸橼酸三钠（天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20070509）；枸橼酸（沈阳正信高科技研究所试剂部，批号：20050723）；氯化钠（天津市北方天医化学试剂厂，20070103）。

　　1.2 动物分组与模型制作动物：昆明种小鼠100只，体重18～22 g，雌雄各半；白色豚鼠，体重350～450 g，雄性，沈阳药科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（辽）2003-008，饲养于室温（22±3）°C，湿度（50±20）%，自动通风的环境中。随机分为碳粒廓清实验用5组：荷瘤对照组、荷瘤华蟾素乳剂给药组、荷瘤环磷酰胺给药组、荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组及正常对照组，每组10只。除正常对照组外，其他各组小鼠右腹下皮下接种Lewis肺癌细胞2×106个。以及溶血素实验用5组：荷瘤对照组、荷瘤华蟾素乳剂给药组、荷瘤环磷酰胺给药组、荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组及正常对照组，每组10只。

　　1.3 实验方法[8-9]

　　小鼠接种Lewis肺癌细胞后第2天开始给药，给药容积为10 ml/kg。荷瘤华蟾素乳剂给药组：每日1次腹腔注射华蟾素乳剂80 μg/kg；荷瘤环磷酰胺（CTX）给药组：每日1次腹腔注射CTX 10 mg/kg；荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组：每日1次同时注射华蟾素乳剂80 μg/kg和CTX 10 mg/kg；荷瘤对照组和正常对照组：每次腹腔注射生理盐水（NS） 0.4 ml，每日1次。疗程均为14 d。

　　1.3.1 华蟾素乳剂对肿瘤重量及生长抑制率的影响[10]于第15天观察小鼠体重变化，经眼球采血后测定各项免疫功能指标，取出各组荷瘤小鼠瘤体，称重后计算肿瘤生长抑制率。

　　肿瘤生长抑制率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/ 对照组平均瘤重×100%。

　　1.3.2 对碳粒廓清的影响[11]于第15天末次给药60 min后，尾静脉注射用生理盐水稀释3倍的印度墨汁，给药容积为10 ml/kg，分别于注射后1 min和11 min从眼眶后静脉取血40 μl，溶于4 ml 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，置721分光光度计在波长600 nm下比色测定光密度（OD），以0.1%Na2CO3溶液校零。最后将小鼠处死，称体重、肝重和脾重。按下式计算廓清指数K和校正廓清指数α。

　　K=（lgOD1-lgOD2）/t2-t1；α=K1/3×体重/（肝重+脾重）OD1和OD2为不同时间所取血样的光密度，t2-t1为取两血样的时间差。

　　1.3.3 对溶血素的影响从给药后第9天开始，所有5组鼠均腹腔注射5%生理盐水鸡红细胞混悬液0.5 ml进行免疫。于第16天末次给药60 min后摘眼球取血，离心，取血清稀释50倍，取稀释血清1 ml与5%生理盐水鸡红细胞混悬液0.5 ml、10%补体混合，在37℃恒温箱中保温30 min后，0℃冰箱中中止反应。离心，取上清液于721分光光度计540 nm处比色，测定OD，另设不加血清的空白对照，取其上清液作为比色时调零的基准。以该OD读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。其中鸡红细胞在4℃冰箱于Alsever氏液中保存，临用时用生理盐水洗涤3次，配成5%生理盐水鸡红细胞混悬液即可。补体以3只豚鼠的血清混合，用生理盐水配成10%（即1∶10）。Alsever氏液：枸橼酸三钠·2H2O 8.0 g，枸橼酸0.5 g，无水葡萄糖18.7 g，氯化钠4.2 g，蒸馏水加至1 000 ml，过滤分装，10磅高压20 min 4℃冰箱保存备用。鸡红细胞混悬液：于无菌条件下，自鸡翼下静脉采血，置100 ml疫苗瓶中，加入相当于鸡血体积5倍的Alsever氏液，混匀，4℃冰箱保存。临用时用生理盐水洗涤，离心（532.5 g，5 min）3次，直至血细胞比容值恒定，弃上清液和界面白细胞层。

　　1.4 统计学方法计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果2.1 华蟾素乳剂对肿瘤重量及生长抑制率的影响荷瘤华蟾素乳剂给药组、荷瘤环磷酰胺给药组及荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组肿瘤重量均低于荷瘤对照组，而抑制率均高于荷瘤对照组；荷瘤华蟾素乳剂给药组与荷瘤环磷酰胺给药组的瘤重和抑制率相近；联合给药组的瘤重明显低于荷瘤华蟾素乳剂给药组和荷瘤环磷酰胺给药组，而抑制率明显高于荷瘤华蟾素乳剂给药组和荷瘤环磷酰胺给药组，提示华蟾素乳剂不仅对小鼠Lewis肺癌实体瘤有抑制作用，而且与环磷酰胺有协同效果（表1）。

　　荷瘤华蟾素乳剂给药组、荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组体重增加分别为（9.91±1.84） g（P＜0.001）、（7.83±2.98） g（P＜0.01），明显高于荷瘤对照组的（4.02±1.80） g，而荷瘤化疗组较正常对照组的体重增加（11.37±1.52） g明显减轻（P＜0.001）。提示华蟾素乳剂给药可使荷瘤小鼠体重明显增加，改善荷瘤小鼠的生存质量，而荷瘤环磷酰胺给药组为（4.32±2.49） g，影响小鼠的生存质量。

　　2.2 华蟾素乳剂对小鼠碳粒廓清能力的影响荷瘤对照组、荷瘤华蟾素乳剂给药组、荷瘤环磷酰胺给药组及荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组K值和α值均低于正常对照组，但是荷瘤华蟾素乳剂给药组的K值无明显降低；而且荷瘤华蟾素乳剂给药组的α值明显高于荷瘤对照组，显示华蟾素乳剂给药后可以显著提高荷瘤小鼠的碳粒廓清能力。荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组的K值明显高于荷瘤环磷酰胺联合给药组，提示华蟾素乳剂不仅提高荷瘤小鼠的碳粒廓清能力，而且可以改善由于环磷酰胺导致的碳粒廓清能力降低（表2）。

　　表2 华蟾素乳剂对小鼠碳粒廓清能力的影响（x±s，n=10）Tab.2 Effects of Huachansu Parenteral Emulsion on the carbon clearance test in mice （x±s, n=10）注：与正常对照组相比，※P＜0.05，※※P＜0.01，※※※P＜0.001；与荷瘤对照组相比，**P＜0.01；与荷瘤环磷酰胺给药组相比，#P＜0.05Note：Compared with normal control group, ※P＜0.05, ※※P＜0.01, ※※※P＜0.001; compared with the bearing cancer vehicle-treated control group, **P＜0.01; compared with the bearing cancer cyclophosphamide-treated group, #P＜0.052.3 华蟾素乳剂对小鼠溶血素的影响荷瘤华蟾素乳剂给药组、荷瘤环磷酰胺给药组及荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组OD值均明显低于正常对照组，而荷瘤华蟾素乳剂给药组的OD值无明显降低；而且荷瘤华蟾素乳剂给药组的OD值明显高于荷瘤对照组，显示华蟾素乳剂给药后可以显著提高荷瘤小鼠的溶血素水平。荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组的OD值明显高于荷瘤环磷酰胺联合给药组，提示华蟾素乳剂不仅可提高荷瘤小鼠的溶血素水平，而且可以改善由于环磷酰胺导致的免疫能力降低（表3）。

　　3 讨论肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，对放疗、化疗及免疫治疗的敏感性均较差。因此寻找安全、有效的药物依然是肿瘤治疗工作的重要课题。采用抗肿瘤中药治疗恶性肿瘤是具有中国特色的肿瘤治疗方式[12]。经过近10年的研究和开发，目前已有多种中药制剂获准用于肿瘤的常规治疗。在我们的研究中观察到，荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组的抑瘤率明显高于荷瘤华蟾素乳剂给药组和荷瘤环磷酰胺给药组，提示华蟾素乳剂有一定的抗癌作用和增强化疗效果的作用；除此之外，华蟾素乳剂进入机体后，能剌激机体的免疫系统，增强机体的细胞免疫功能以及体液免疫功能，表现为荷瘤华蟾素乳剂给药组和荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组在给药后廓清指数K和校正廓清指数α明显高于荷瘤对照组和环磷酰胺给药组，血清溶血素水平也明显提高，从而达到治疗肺癌免疫功能低下的目的。本研究结果显示荷瘤华蟾素乳剂给药组和荷瘤华蟾素乳剂与环磷酰胺联合给药组明显好于荷瘤对照组，说明华蟾素乳剂的使用有利于提高生存质量。初步研究发现华蟾素乳剂对Lewis肺癌实体瘤有明显疗效，其作用机制可能与其本身有抗癌作用和增强机体的免疫功能有关，具体作用机制有待进一步探讨。

　　研究表明，华蟾素乳剂能显著增强正常小鼠单核吞噬细胞对碳粒的吞噬功能以及体液免疫功能，使环磷酰胺免疫抑制小鼠碳粒廓清指数K、α值以及溶血素水平恢复至正常水平，有效地恢复和增强继发性免疫功能低下小鼠的细胞免疫功能，具有免疫调节作用，可以提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能和体液免疫功能。